Microscopía electrónica

La microscopía electrónica es una técnica que requiere instrumentos de alta complejidad y personal altamente especializado. Se utilizan la microscopía electrónica de transmisión o convencional y la de barrido. Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 2 aumentos comparados con los de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".

Para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas:
1. La fijación química o la criofijación
2. La inclusión en resinas (criosustitución)
3. La réplica metálica

Las muestras para microscopía electrónica deben fijarse en glutaraldehído, que se solicita al laboratorio de Anatomía Patológica con las instrucciones para la toma y fijación de la muestra. Los fragmentos deben ser pequeños y tienen que fijarse en forma de varios trocitos cuboideos de tejido de no más de 1 mm, obtenidos con hoja de afeitar o bisturí limpios. Las muestras se incluyen en resinas sintéticas (Epon) y se practican cortes 10 veces más delgados que los de microscopía de luz llamados cortes ultrafinos. La tinción se realiza con sales de metales pesados como citrato de plomo, tetróxido de Osmio o acetato de uranilo, que permiten un contraste adecuado del tejido bajo el haz de electrones. Los cortes ultrafinos se montan sobre grillas de cobre, se tiñen y se observan al microscopio electrónico. Para documentar los hallazgos es necesario obtener fotografías en blanco y negro de las preparaciones.

Microscopía electrónica aplicada al diagnóstico

En cuanto a las aplicaciones clínicas, el uso de la microscopía electrónica es de rutina para el diagnóstico de patologías renales. Algunas de las glomerulopatías primarias requieren necesariamente de la ME son: enfermedad de membranas basales delgadas, síndrome de Alport, glomerulopatía fibrilar e inmunotactoide y cambios glomerulares mínimos. Además, es útil, aunque no necesariamente esencial, en el diagnóstico de cualquier otra glomerulopatía.

Por frecuencia, la enfermedad de cambios glomerulares mínimos es la glomerulopatía que más requiere de la ayuda de la ME, ya que es, por definición, un diagnóstico ultraestructural. Sin embargo, en un contexto clínico adecuado, con una muestra representativa de corteza, adecuadas tinciones y una buena inmunofluorescencia se puede llegar a un diagnóstico relativamente confiable en la mayoría de los casos.

En la práctica diaria se reciben muestras de tejido renal obtenido por biopsia percutánea con aguja, biopsia a cielo abierto (cuña de tejido) o nefrectomía (parcial o total). El especimen debe manipularse con mucho cuidado, evitando comprimirlo o fragmentarlo. Cuando se trata de cuñas o nefrectomías no hay problema para seleccionar el material para microscopía de luz convencional, para inmunofluorescencia (IF) y para microscopía electrónica (ME). En algunos casos y centros se procura guardar, además, material congelado para estudios moleculares, aunque el material sobrante del que fue congelado para IF puede ser útil.

 Corte de riñón teñido con H/E.

  

Corte de riñón teñido con PAS                               Impregnación con metenamina de plata en corte de riñón

Idealmente el tejido seleccionado para IF debe ser congelado rápidamente, usualmente en isopentano o metilbutano enfriado en nitrógeno líquido, después de haberlo colocado en OCT (gel para inmersión de muestras para congelación). Algunos autores informan resultados aceptables realizando fluorescencia (no inmunofluorescencia) en muestras procesadas de manera rutinaria, pero fijadas en fijador de Hollande, para detectar depósitos inmunes.

El material para ME debe colocarse en cubículos de 1 mm y luego en glutaraldehído frío tan pronto como sea posible. En casos necesarios, el tejido incluído en parafina puede recuperarse para ME, pero la calidad de las imágenes disminuye marcadamente.

No hay un número mínimo de glomérulos indispensable para un adecuado diagnóstico. En lesiones globales y difusas un solo glomérulo puede ser suficiente. En lesiones segmentarias, o en casos de cambios mínimos, mientras mayor número de glomérulos mejor, pero esperamos estudiar al menos 20.

          Corte ultrafino de ratón contrastado con tetróxido de osmio, acetato de uranilo y citrato de plomo

Técnica Histológica

Se define técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio.

El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, después de haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro órgano visual. Por esa causa, debe ser reducido a láminas muy delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que serán descritas más adelante.

OBTENCIÓN DE LA PIEZA
El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano.

FIJACIÓN
La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.


DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA

Deshidratación
- Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente.

Penetración de la parafina
- Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
- Penetración de la parafina a 56-58ºC.

Inclusión definitiva o formación del bloque
En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera.

OBTENCIÓN DE CORTES
El objeto de la inclusión que hemos descrito anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.
Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo.

COLORACIÓN
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración.
Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.
Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante.

Clasificación de los colorantes:

Según su origen se clasifican en:
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):
- Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.
- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).

Por otro lado, las coloraciones pueden ser:
- Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada.
- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.

MONTAJE
Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.

En este vídeo se muestra el procedimiento para teñir con Hematoxilina/ Eosina un corte histológico.

Resultado de la técnica histológica luego de realizarla en un corte

En estas dos imágenes se observa un corte histológico de un riñón humano tratado con una tinción de rutina Hematoxilina/ Eosina, sin embargo, en la imagen superior se observa una buena aplicación de la técnica, mientras que en la inferior, se observa una coloración deficiente. En la imagen inferior se fijó la muestra por más tiempo del adecuado, por lo que no quedaron grupos reactivos de la muestra que interactuaran con los colorantes, observándose más pálida que la imagen superior.

En este caso, en la imagen de la izquierda se observa una buena tinción H/E en un corte de músculo liso. Se observan los citoplasmas eosinófilos y los núcleos contrastados con hematoxilina. En la imagen de la derecha  en cambio, no se logró una buena tinción debido a que el tiempo de desparafinación fue muy corto, impidiendo que los colorantes interactuaran con los grupos reactivos de la muestra.

 Finalmente, en la imagen de la izquierda se observa una buen tinción H/E en un corte de hígado mientras que en la imagen derecha se observa una cargada eosinofilia debido a una tinción muy larga con este colorante.