lunes, 1 de diciembre de 2014

Técnica Histológica

Se define técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio.

El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, después de haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro órgano visual. Por esa causa, debe ser reducido a láminas muy delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que serán descritas más adelante.


OBTENCIÓN DE LA PIEZA
El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano.

FIJACIÓN
La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.


DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA

Deshidratación
- Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente.

Penetración de la parafina
- Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
- Penetración de la parafina a 56-58ºC.

Inclusión definitiva o formación del bloque
En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera.

OBTENCIÓN DE CORTES
El objeto de la inclusión que hemos descrito anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.
Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo.

COLORACIÓN
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración.
Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.
Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante.

Clasificación de los colorantes:

Según su origen se clasifican en:
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):
- Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.
- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).

Por otro lado, las coloraciones pueden ser:
- Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada.
- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.

MONTAJE
Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.
En este vídeo se muestra el procedimiento para teñir con Hematoxilina/ Eosina un corte histológico.


Resultado de la técnica histológica luego de realizarla en un corte




En estas dos imágenes se observa un corte histológico de un riñón humano tratado con una tinción de rutina Hematoxilina/ Eosina, sin embargo, en la imagen superior se observa una buena aplicación de la técnica, mientras que en la inferior, se observa una coloración deficiente. En la imagen inferior se fijó la muestra por más tiempo del adecuado, por lo que no quedaron grupos reactivos de la muestra que interactuaran con los colorantes, observándose más pálida que la imagen superior.



















En este caso, en la imagen de la izquierda se observa una buena tinción H/E en un corte de músculo liso. Se observan los citoplasmas eosinófilos y los núcleos contrastados con hematoxilina. En la imagen de la derecha  en cambio, no se logró una buena tinción debido a que el tiempo de desparafinación fue muy corto, impidiendo que los colorantes interactuaran con los grupos reactivos de la muestra.










 Finalmente, en la imagen de la izquierda se observa una buen tinción H/E en un corte de hígado mientras que en la imagen derecha se observa una cargada eosinofilia debido a una tinción muy larga con este colorante.
 

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